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人孕酮(PROG)定量檢測試劑盒(ELISA)-競爭法

更新時(shí)間:2024-05-30      瀏覽次數:131

定量檢測血清、血漿、細胞培養上清液中人孕酮PROG)的濃度。

人孕酮(PROG)定量檢測試劑盒(ELISA)-競爭法 

 

使用試劑盒前,必須仔細閱讀本說(shuō)明書(shū)。

 

 


實(shí)驗原理

本試劑盒采用競爭法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。在預包被抗人孕酮(PROG)抗體(固相抗體)的微孔酶標板中,加入人孕酮(PROG)校準品和待測樣本,再加入HRP標記的人孕酮(PROG)抗原(酶標抗原),經(jīng)過(guò)溫育與充分洗滌,去除未結合的組分,在微孔板固相表面形成固相抗體-酶標抗原的免疫復合物。加底物A和B,底物在HRP催化下,產(chǎn)生藍色產(chǎn)物,在終止液(2M 硫酸)作用下,最終轉化為黃色,在酶標儀450nm波長(cháng)上測定吸光度(OD值),吸光度(OD值)與待測樣品中人孕酮(PROG)的濃度負相關(guān)。擬合校準品曲線(xiàn),可以計算出樣本中人孕酮(PROG)的濃度。

 

試劑盒限制性

1、 僅供科研使用,不得用于臨床診斷。

2、 在試劑盒標示的有效期內使用,過(guò)期產(chǎn)品不得使用。

3、 跟其他廠(chǎng)家的試劑盒或者組分不能混用。

4、 使用試劑盒配套的樣品稀釋。

5、 如果樣本值高于最高標準品濃度值,請將樣本適當稀釋后,再重新測定。

6、 待測樣本中存在的人抗鼠等異嗜抗體會(huì )干擾檢測結果,檢測前,請排出該因素。

7、 通過(guò)其他方法得到的檢測結果,與本試劑盒測定結果不具有直接的可比性。

技術(shù)提示

1、 混合蛋白溶液時(shí),避免泡。

2、 加校準品與樣本時(shí),每個(gè)校準品濃度和樣本都要更換移液槍頭,公共組分應該懸臂加樣,避免交叉污染。

3、 合適的溫育時(shí)間,和充分的洗滌步驟,是保證實(shí)驗結果準確性的必要條件。

4、 使用自動(dòng)洗板機時(shí),加入一個(gè)30秒浸泡的步驟,可提高檢測精度。

5、 底物溶液為無(wú)色液體,保存過(guò)程中變?yōu)樗{色,代表底物溶液已經(jīng)失效,不得使用。

6、 終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致,加入終止液后,藍色底物產(chǎn)物,會(huì )瞬間變?yōu)辄S色。

7、 實(shí)驗中,用剩的板條,應立即放回自封袋中,密封(低溫干燥)保存。

8、 所有液體組分,使用前充分搖勻,嚴格按照說(shuō)明書(shū)標明的時(shí)間、加樣量及加樣順序進(jìn)行溫育操作。

 

試劑盒組分與保存

未開(kāi)封的試劑盒保存在2-8度,不得使用過(guò)期試劑盒。

組分

數量

主要成分

開(kāi)封后儲存

校準品

0.3ml/管

--

2-814天

包被微孔板

96T/48T

預包被固相抗體

2-814天

HRP標記抗原

10mL

HRP標記的檢測抗原

2-8180天

底物液A

6mL

0.01%過(guò)氧化氫

2-8180天

底物液B

6mL

0.1%TMB

2-8180天

終止液

6mL

2mol/L稀硫酸

2-8180天

樣本稀釋液

6mL

PBS

2-8180天

20×濃縮洗滌液

25mL

0.05%Tween20

2-8180天

說(shuō)明書(shū)

1份

--

--

自封袋

1個(gè)

--

--

不干膠

2片

--

--

標準品濃度依次為:8、4、2、1、0.5、0 nmol/L.

其他用品

1、 酶標儀(450nm)

2、 精密移液器及一次性吸頭

3、 蒸餾水

4、 洗瓶或者自動(dòng)洗板機

5、 37水浴鍋或恒溫箱

6、 500ml量筒

 

生物安全

1、 檢測必須符合實(shí)驗室管理規范的規定,嚴格防止交叉污染,所有樣品、洗棄液和各種廢棄物都應按照傳染物進(jìn)行處置。

2、 試劑盒的液體組分中,含有proclin-300防腐劑,可能引起皮膚過(guò)敏反應,避免吸入煙霧與皮膚接觸。

3、 底物液對皮膚、眼睛和上呼吸道有刺激作用,避免吸入煙霧。

4、 戴上防護手套,實(shí)驗完成后洗手。

 

樣品的采集和儲存

以下只是列出樣品采集和保存的一般指南。所有樣本采集保存過(guò)程中,不得使用疊氮鈉做為防腐劑。

1、 細胞培養上清:4000rpm條件下離心20min,去除細胞顆粒和聚合物,上清液保存- 20以下,避免反復凍融。

2、 血清使用不含熱原和內毒素的試管,操作過(guò)程中避免任何細胞刺激,4000rpm條件下離心20min,小心地分離出血清,保存-20以下,避免反復凍融。

3、 血漿肝素,EDTA,或檸檬酸鈉作為抗凝劑。在4000rpm條件下,離心20分鐘取上清,血漿保存-20以下,避免反復凍融。

樣本收集后,無(wú)法一次檢測完畢,請按一次用量分裝凍存,避免反復凍融,使用時(shí)在室溫下解凍,確保樣品均勻充分解凍。

4、 組織勻漿:用預冷的PBS (0.01 M,pH=7.4)沖洗組織,去除殘留血液,稱(chēng)重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS(一般按1: 9的重量體積比,比如1g的組織樣品對應9 mL的PBS,具體體積可根據實(shí)驗需要適當調整,并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,在冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細胞,可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎或反復凍融。最后將勻漿液5000×g離心 5-10分鐘,取上清檢測。

5、 細胞提取液:貼壁細胞用冷的PBS輕輕清洗,然后用胰蛋白酶消化,1000×g離心5分鐘后收集細胞;懸浮細 胞可直接離心收集。收集的細胞用冷的PBS洗滌3次。每 1×106 個(gè)細胞中加入150-200μLPBS重懸并通過(guò)復凍融使細胞破碎(若含量很低可減少PBS的體積)。將提取液于1500×g離心10分鐘,取上清檢測。  

6、 其他生物體液:1000×g 離心20分鐘,除去雜質(zhì)及細胞碎片。取上清檢測。

 

試劑準備

1、 使用前,所有的組分都要至少復溫60min,確保充分復溫到室溫。

2、 濃縮洗滌液:從冰箱取出的濃縮洗滌液,會(huì )有結晶產(chǎn)生,這屬于正?,F象,水浴加熱使結晶溶解。濃縮洗滌液與蒸餾水,按1:20稀釋?zhuān)?份的濃縮洗滌液,添加19份的蒸餾水。

3、 底物:底物液A和B,在使用前,按1:1體積充分混合,混合后15分鐘內使用。

 

 

操作程序

所有試劑和組分都先恢復到室溫,標準品、質(zhì)控品和樣品,建議做復孔。

1、 按前面說(shuō)明書(shū)描述的方法,配制好試劑盒各種組分的工作液。

2、 從鋁箔袋中取出所需板條,剩余的板條用自封袋密封放回冰箱。

設置標準品孔、空白孔和樣本孔,標準品孔各加不同濃度的標準品50μL,空白孔不加,樣本孔加待測樣本50μL。

3、除空白孔外,標準品孔和樣本孔,加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標記的檢測抗原100μL。

4、 用封板膜蓋住反應板,37水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5、 揭開(kāi)封板膜,棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿(mǎn)洗滌液,靜置20S,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復5次。若使用自動(dòng)洗板機,請按洗板機操作程序進(jìn)行洗板,添加浸泡30s的程序,可以提高檢測的精度。洗板結束,加底物前,要在干凈不掉屑的紙上,充分拍干反應板。

6、 將底物A和B按1:1體積充分混合,所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜蓋住反應板,37水浴鍋或恒溫箱溫育15min。

7、 所有孔加入終止液50μL,在酶標儀上讀取各孔吸光度(OD值)。

結果計算

1、 以標準品濃度做為橫坐標,對應的吸光度(OD值)作為縱坐標,利用計算機軟件,采用四參數Logistic曲線(xiàn)擬合(4-pl),創(chuàng )建標準曲線(xiàn)方程,通過(guò)樣本的吸光度(OD值),利用方程計算樣品的濃度值。

2、 如果樣品被稀釋?zhuān)ㄟ^(guò)上述方法測的濃度值,要乘以稀釋倍數,才是樣品的最終濃度。 

 


試劑盒性能指標

1、物理性能

試劑盒的各液體組分應澄清透明、無(wú)沉淀或者絮狀物。微孔板鋁箔袋應真空包裝,無(wú)破損漏氣。

2、劑量反應曲線(xiàn)線(xiàn)性

校準品劑量反應曲線(xiàn)相關(guān)系數r值,大于等于0.9900。

3、精密度

批內精密度:已知的高、中、低濃度樣品,進(jìn)行二十次在一個(gè)板塊內精度評估。批內變異系數CV%小于10%。

批間精密度:已知的高、中、低濃度樣品,進(jìn)行二十次在不同板塊內精度評估。批間變異系數CV%小于15%。

4、靈敏度

檢出劑量小于0.1 nmol/L。

5、回收率

已知的高、中、低濃度樣品,進(jìn)行次在一個(gè)板塊內回收率評估,回收率在85%-115%之間。

6、特異性

本試劑盒識別天然和重組人孕酮(PROG),與結構類(lèi)似物無(wú)交叉。

7、穩定性

2-8保存,有效期6個(gè)月。

8、 檢測范圍

0.25 nmol/L - 8 nmol/L


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